科研 线粒体 线粒体自噬 上次在线粒体自噬体荧光检测的笔记中，有同学问了猫老师下面几个问题。 1. 不同文献对线粒体染色不同 ，有TOM20，COXIV，HSP60等，还有mitotracker 该怎么选择吗？ 这里面除了MitoTacker是线粒体染料外，TOM20和Hsp60为线粒体外膜蛋白，COXIV为线粒体内膜蛋白，都可以表征线粒体。他们的差别在于MitoTacker需要染色，一般来说可用于线粒体固定的染料主要是红光和远红，没有绿光的可固定线粒体染料，另外染料固定后存在染料外溢导致背景高的可能，甚至不好染色，所以需要在自己的细胞上优化染色条件。固定后的通透过程有时候也会对染料产生影响，通透后染料荧光可能会降低或者增加背景。而线粒体蛋白的抗体染色首要条件是抗体要好用，在同等好用的抗体下，三个蛋白里一般来说外膜蛋白染色标记比内膜蛋白染色更容易。 Mitotracker加完再固定透化 这里是加完多久呢以及用多少浓度呢 ？ 这个需要依据染料说明书来，并且要在自己的细胞上优化条件。一般来说线粒体染料固定推荐用多聚甲醛固定，最好不要用冰甲醇，冰甲醇同时具备固定通透的效果，但冷击有时候会影响线粒体形态，且可能造成染料外溢导致染色效果不佳。 如果是多重染色，该怎么敷育抗体？ 如果是多个抗体染色，一般来说可以一抗同时敷育，二抗同时敷育，无需先敷育一个抗体后再敷育另一个。